用途 ：本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測偶蹄動(dòng)物水泡皮、水泡液及OP液中的口蹄疫病毒 （FMDV）的RNA。適用于FMDV的診斷、檢測和流行病學(xué)調(diào)查。 原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取樣品總RNA，在高效反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以 引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在熱啟動(dòng)Taq 酶的作用下，經(jīng)高溫變性、中溫退火 及延伸的循環(huán)，使特異DNA片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的DNA雜交，利 用Taq 聚合酶的5'→3'外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利 用熒光PCR儀檢測特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品Ct值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

試劑盒組成 ：詳見說明書

保存期 ：本產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。

需要自備的物品

1．儀器：分析天平、離心機(jī)、熒光PCR擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。

2．耗材：熒光PCR專用反應(yīng)管、眼科剪、眼科鑷、生理鹽水、1.5 mL經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水 處理的滅菌離心管、吸頭（10 μL、200 μL、1000 μL）、滅菌雙蒸水。

注意事項(xiàng)

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

2．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán) 禁器材和試劑倒流。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)完全融化，8000 rpm離心15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。

4．在RNA提取過程中，避免RNA酶污染，盡量縮短操作時(shí)間。

5．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

6．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。

7．反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，本試劑盒應(yīng)在3次內(nèi)用完，請(qǐng)嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺動(dòng)物，取水泡皮及水泡液；待檢活動(dòng)物，取OP液2～3 mL。2～8 ℃保存， 送實(shí)驗(yàn)室檢測。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料。）

2 樣品處理：每份樣品分別處理。

2.1 組織樣品處理：稱取水泡皮0.05 g于研磨器中研磨，加入生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5 mL滅菌離心管中，8000 rpm離心2 min，取上清液100 μL于1.5 mL滅菌離心管中。

2.2 液體樣品處理：取OP液或水泡液樣品100 μL，置1.5 mL滅菌離心管中。

2.3 陽性對(duì)照處理：取陽性對(duì)照100 μL，置1.5 mL滅菌離心管中。 2.4 陰性對(duì)照處理：取陰性對(duì)照100 μL，置1.5 mL滅菌離心管中。

操作步驟 詳見說明書